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着手一个噬菌体展示项目12

实验方案1.1 滴定及增殖噬菌斑纯化的丝状噬菌体12

文库的构建和保存25

实验方案2.1 dU-ssDNA模板的分离25

实验方案2.2 噬菌体文库的构建27

实验方案2.3 大肠杆菌的电转化和噬菌体的繁殖29

实验方案2.4 噬菌体展示文库的再增殖30

生物试剂31

实验方案2.5 感受态大肠杆菌SS320的制备31

实验方案2.6 制备辅助噬菌体储液32

体外DNA重组的方法36

实验方案3.1 DNA改组36

实验方案3.2 DNA的随机片段化37

实验方案3.3 随机引物重组39

实验方案3.4 StEP DNA重组40

实验方案3.5 异源双链重组：异源双链质粒41

实验方案3.6 异源双链重组：异源双链插入片段41

实验方案3.7 使用尿嘧啶DNA糖基化酶对含有尿嘧啶的DNA去污染44

载体的考虑50

实验方案4.1 用大肠杆菌XL1-blue菌株制备噬菌体50

靶标的呈递54

实验方案4.2 靶标的包被及噬菌体的结合54

实验方案4.3 噬菌体结合的ELISA检测56

筛选58

实验方案4.4 噬菌体结合筛选、洗涤及洗脱58

实验方案4.5 富集度的监测59

分析前的鉴定61

实验方案4.6 噬菌体克隆鉴定61

噬菌体结合性检测的进行68

实验方案5.1 靶标包被的微孔板的准备68

实验方案5.2 固定化的包被试剂和加入的噬菌体的滴定69

实验方案5.3 噬菌体结合性检测70

构建pⅧ噬菌粒随机肽库77

实验方案6.1 构建pⅧ噬菌粒库：载体的准备77

实验方案6.2 构建pⅧ噬菌粒库：插入片段的准备77

实验方案6.3 构建pⅧ噬菌粒库：连接插入片段与BstⅪ消化的p8V5载体79

实验方案6.4 构建pⅧ噬菌粒库：扩增与储存80

筛选pⅧ噬菌粒库82

实验方案6.5 筛选pⅧ噬菌粒库：亲和筛选82

实验方案6.6 筛选pⅧ噬菌粒库：所筛选噬菌体的扩增82

鉴定所获取的克隆83

实验方案6.7 筛选pⅧ噬菌粒库：通过噬菌体ELISA鉴定得到的噬菌体克隆83

冠状二聚体库的亲和筛选86

实验方案6.8 冠状二聚体系统展示的肽复合物的亲和筛选86

底物筛选程序93

实验方案7.1 底物噬菌体筛选93

筛选出的序列的鉴定98

实验方案7.2 AP融合蛋白的构建和测定98

一般步骤及一个特例——从一个具有疏水性核心的突变体文库中筛选稳定的泛素变异体实验方案8.1 用循环PCR来组装双链的简并诱变寡核苷酸105

实验方案8.2 黏末端定向的突变生成随机化文库107

实验方案8.3 电转化和噬菌粒文库的储存，甘油保种的制备以及筛选所需的噬菌体的制备108

实验方案8.4 用SPR对蛋白-噬菌体复合体单克隆的蛋白酶解的监测112

实验方案8.5 使用Ni-NTA琼脂糖珠的基于蛋白酶的噬菌体文库筛选114

噬菌体文库卡匣的构建120

实验方案9.1 文库卡匣的构建120

噬菌体载体的制备及文库的构建122

实验方案9.2 噬菌体载体DNA的预处理及结合蛋白库的克隆122

噬菌体的筛选124

实验方案9.3 噬菌体DNA/RNA结合性筛选的标准程序124

对筛选出的噬菌体克隆的分析126

实验方案9.4 借助于噬菌体ELISA的DNA/RNA结合活性的分析126

筛选过程131

实验方案10.1 活体筛选131

实验方案10.2 体外筛选135

单个噬菌体的鉴定138

实验方案10.3 插入区域的PCR扩增138

实验方案10.4 PCR产物的测序139

实验方案10.5 在石蜡包埋的组织上进行免疫组化141

实验方案10.6 在新冷冻的组织上进行免疫荧光142

实验方案10.7 荧光标记多肽的注射以及血管通过体内凝集素染色的显现144

噬菌体文库的构建148

实验方案11.1 构建基于pⅢ和pⅧ的天然表位文库（HCV基因组）148

结合血清抗体的噬菌体展示肽的筛选149

实验方案11.2 用于噬菌体感染的细菌细胞（TB细胞）的制备149

实验方案11.3 UV灭活载体噬菌体的制备149

实验方案11.4 用抗人抗体包被微珠150

实验方案11.5 文库的筛选151

实验方案11.6 扩增来自淘洗的噬菌体群落152

筛选单个克隆154

实验方案11.7 用于噬菌体展示文库的菌落试验154

实验方案11.8 基于DNA的筛选157

已选择克隆的鉴定159

实验方案11.9 小规模制备噬菌体上清159

实验方案11.10 用噬菌体上清和人血清进行ELISA160

实验方案11.11 用人血清进行噬菌体ELISA161

实验方案11.12 大量制备噬菌粒克隆162

实验方案11.13 与噬菌体展示的多肽反应的血清抗体的亲和纯化162

实验方案11.14 交叉抑制实验163

实验方案11.15 PCR扩增的模板164

表位成熟166

实验方案11.16 表位成熟166

在基于gⅥ的展示载体中克隆cDNA文库173

实验方案12.1 从预制的λGT11文库中制备cDNA插入片段173

实验方案12.2 大规模连接及纯化连接后的DNA175

实验方案12.3 Top10F′细胞中的电转化及文库储存176

gⅥ-cDNA融合噬菌体亲和选择177

实验方案12.4 gⅥ-cDNA噬菌粒文库的获取和纯化177

实验方案12.5 使用生物素抗原来选择gⅥ-cDNA噬菌体文库179

实验方案12.6 用免疫亲和反应选择gⅥ-cDNA噬菌体文库180

对选择出的克隆进行分析181

实验方案12.7 gⅥ-cDNA噬菌粒文库小规模的获取和纯化181

实验方案12.8 噬菌体ELISA182

噬菌体抗体文库构建195

实验方案13.1 从外周血淋巴细胞（PBLs）中分离RNA195

实验方案13.2 cDNA第一链的合成196

实验方案13.3 从cDNA第一链中扩增VH和VL基因197

实验方案13.4 制备scFv接头DNA199

实验方案13.5 用scFv接头PCR装配VH和VL进行scFv基因文库的构建200

实验方案13.6 再扩增scFv基因文库以添加限制性位点进行克隆201

实验方案13.7 对scFv基因文库及pHEN1噬菌体展示载体的限制性消化201

实验方案13.8 scFv和载体DNA的连接202

实验方案13.9 电感受态大肠杆菌TG1的制备203

实验方案13.10 电转化连接物及构建抗体文库204

制备用于抗原上选择的噬菌体抗体206

实验方案13.11 自文库甘油储存料中制备噬菌体抗体206

实验方案13.12 用氯化铯离心法纯化噬菌体208

从噬菌体文库中选择抗原特异性抗体210

实验方案13.13 在固相抗原上选择噬菌体抗体210

实验方案13.14 用可溶性生物素化抗原进行选择211

识别鉴定抗原结合性抗体213

实验方案13.15 在微量滴定板中表达噬菌体抗体213

实验方案13.16 噬菌体抗体ELISA214

实验方案13.17 在微量滴定板中表达可溶性scFv215

实验方案13.18 在微量滴定板中进行可溶性scFv ELISA216

实验方案13.19 用PCR识别不同的噬菌体抗体克隆217

在哪里又如何对抗体基因序列进行多样化225

实验方案14.1 用突变的VLCDR3构建scFv基因文库225

实验方案14.2 再扩增scFv VL CDR3基因文库添加3′限制性位点226

实验方案14.3 连接scFv和载体DNA并转化大肠杆菌，构建scFv突变文库227

实验方案14.4 VH CDR3基因文库和VL基因的扩增228

实验方案14.5 PCR剪接VHCDR3基因文库和VL基因构建scFv基因文库229

实验方案14.6 构建人VH基因节段文库232

实验方案14.7 再扩增VH基因文库添加3′限制性位点并克隆创建VH基因节段文库233

实验方案14.8 创建重链改组噬菌体文库234

实验方案14.9 人VL基因文库的构建236

实验方案14.10 创建轻链改组噬菌体文库237

选择和筛选亲和力更高的抗体238

实验方案14.11 平衡法选择高亲和力噬菌体抗体238

筛选解离速率优化的scFv240

实验方案14.12 用Biacore仪筛选解离速率较低的scFv240

第1章 噬菌体生物学及噬菌体展示简介1

1.1 简介1

1.2 丝状噬菌体生物学1

1.2.1 简介1

1.2.2 噬菌体颗粒的结构2

1.2.3 感染4

1.2.4 复制5

1.2.5 基因和基因表达5

1.2.6 噬菌体装配生理学6

1.2.7 噬菌体装配机制7

1.3 噬菌体展示所使用的衣壳蛋白8

1.3.1 pⅧ蛋白8

1.3.2 pⅢ蛋白8

1.4 着手一个噬菌体展示项目9

1.4.1 展示的可行性9

1.4.2 噬菌体载体还是噬菌粒载体？10

1.4.3 多价展示还是单价展示？10

1.4.4 辅助噬菌体12

1.4.5 噬菌体制备及定量的一般实验方案12

1.5 一个噬菌体展示项目的一般规则14

1.5.1 一个文库的生成14

1.5.2 筛选15

1.5.3 克隆的分析15

1.6 常见的问题16

1.6.1 文库的质量16

1.6.2 表达的编辑16

1.6.3 过度筛选17

1.7 作为替代的展示系统17

1.8 噬菌体展示文库及试剂盒的商业来源17

参考文献18

第2章 使用寡核苷酸定向诱变构建噬菌体展示文库21

2.1 简介21

2.2 文库设计的考虑21

2.2.1 点突变21

2.2.2 简并密码子的设计21

2.2.3 理论的和实际的多样性22

2.3 定点诱变22

2.3.1 定点诱变与盒式诱变的比较22

2.3.2 寡核苷酸定向诱变的化学和生物学23

2.3.3 无活性模板的构建24

2.4 文库的构建和保存24

2.4.1 单链DNA模板的制备24

2.4.2 异源双链CCC-dsDNA的体外合成26

2.4.3 大肠杆菌的电转化和文库噬菌体的制备28

2.4.4 文库的保存和再感染30

2.5 生物试剂31

参考文献32

第3章 体外DNA重组34

3.1 导言34

3.2 体外DNA重组的本底34

3.2.1 体外DNA重组在定向进化中的使用34

3.2.2 体外DNA重组的应用35

3.2.3 重组统计学35

3.3 体外DNA重组的方法35

3.3.1 Stemmer法35

3.3.2 来自大肠杆菌的内切核酸酶V的DNA的随机片段化37

3.3.3 随机引物重组38

3.3.4 交错延伸程序38

3.3.5 体外异源双链的形成和体内修复（异源双链重组）40

3.3.6 重组方法的选择42

3.3.7 本底的消除44

3.3.8 技术要点45

参考文献46

第4章 为提高蛋白及多肽的亲和性及特异性的噬菌体筛选策略47

4.1 简介47

4.2 载体的考虑48

4.2.1 单价和多价噬菌体展示48

4.2.2 确保展示的成功49

4.2.3 通过噬菌粒载体的蛋白质表达49

4.2.4 载体的构建及噬菌粒的制备50

4.3 文库的设计51

4.3.1 硬随机突变52

4.3.2 软随机突变52

4.4 靶标的呈递53

4.4.1 直接固定53

4.4.2 溶液中的结合54

4.4.3 封闭54

4.4.4 预筛选54

4.5 筛选56

4.5.1 结合缓冲液的考虑56

4.5.2 选择压56

4.5.3 竞争筛选57

4.5.4 已结合的噬菌体的洗脱57

4.5.5 扩增59

4.5.6 筛选的监控59

4.6 分析前的鉴定61

4.7 DNA序列分析61

4.7.1 测序的时机61

4.7.2 序列的一致和同源62

4.7.3 对一致性的评价62

4.7.4 对噬菌体克隆的评价63

4.8 疑难问题的排解63

参考文献64

第5章 用噬菌体ELISA快速鉴定噬菌体展示蛋白的结合亲和性66

5.1 简介66

5.2 噬菌体结合性检测的主导参数66

5.3 噬菌体结合性检测的进行68

5.3.1 噬菌体样本的制备68

5.3.2 加入的噬菌体和固定化靶标的滴定68

5.3.3 与靶标结合的噬菌粒的测定70

5.3.4 置换曲线的拟合71

5.4 结语72

参考文献72

第6章 使用重组肽库为受体识别新配体73

6.1 简介73

6.2 肽段展示系统简介73

6.3 构建pⅧ噬菌粒随机肽库75

6.4 筛选pⅧ噬菌粒库81

6.5 鉴定所获取的克隆83

6.6 先导肽的优化策略84

6.7 用“冠状二聚体”系统构建次级库85

6.8 冠状二聚体库的亲和筛选86

6.9 转移到麦芽糖结合蛋白中分析87

6.10 结论88

参考文献88

第7章 底物噬菌体展示90

7.1 简介90

7.2 底物文库的构建91

7.2.1 相互结合位点的选择92

7.2.2 底物卡匣（cassette）的设计和构建92

7.3 底物筛选程序93

7.4 筛选出的序列的鉴定96

7.4.1 初始的序列分析96

7.4.2 “表达编辑”以及其他潜在的复杂化因素96

7.4.3 底物的详细鉴定96

7.5 方法的延伸以及未来的方向99

7.5.1 底物消减文库100

7.5.2 肽段连接酶的底物特异性100

7.5.3 蛋白激酶的底物特异性100

7.5.4 用反转录病毒展示载体（retroviral display vector）进行的体内筛选100

7.6 结论101

参考文献101

第8章 从噬菌体展示文库中对稳定折叠的蛋白质及蛋白质结构域进行的基于蛋白酶的筛选102

8.1 简介102

8.2 方法概述102

8.3 一般步骤及一个特例——从一个具有疏水性核心的突变体文库中筛选稳定的泛素变异体104

8.3.1 具有疏水性核心的突变体的噬菌粒文库的构建105

8.3.2 噬菌粒文库的鉴定110

8.3.3 稳定折叠的泛素变异体的蛋白酶筛选110

8.4 噬菌体展示中基于蛋白酶的筛选的潜在新用途115

参考文献116

第9章 锌指结构与其他核酸结合性基序的噬菌体展示117

9.1 简介117

9.2 构建一个展示DNA结合性蛋白质的噬菌体文库的初步构想117

9.2.1 噬菌体展示技术合适吗？117

9.2.2 了解蛋白质的DNA结合模式了吗？118

9.2.3 应该随机突变蛋白质的哪一个结构域？118

9.2.4 多价展示还是单价展示？119

9.2.5 蛋白质骨架与筛选策略的选择119

9.3 噬菌体文库卡匣的构建119

9.4 噬菌体载体的制备及文库的构建122

9.5 噬菌体的筛选124

9.6 对筛选出的噬菌体克隆的分析126

致谢127

参考文献127

第10章 噬菌体展示文库在体内及体外的筛选129

10.1 简介129

10.2 体内及体外的噬菌体展示129

10.3 噬菌体载体130

10.4 体内及体外噬菌体展示对照的比较130

10.5 筛选过程130

10.6 单个噬菌体的鉴定137

10.6.1 插入的编码区域的PCR和测序138

10.6.2 单克隆与器官或组织的脉管系统特异性结合的建立140

10.7 结语145

致谢145

参考文献146

第11章 利用血清筛选噬菌体文库147

11.1 介绍147

11.2 噬菌体文库的构建147

11.2.1 随机肽文库147

11.2.2 天然表位文库148

11.3 结合血清抗体的噬菌体展示肽的选择153

11.4 选择策略153

11.4.1 序贯选择153

11.4.2 平行选择153

11.5 筛选单个克隆154

11.5.1 免疫筛选154

11.5.2 基于DNA的筛选156

11.6 已选择克隆的鉴定159

11.6.1 ELISA159

11.6.2 通过亲和纯化鉴定结合特异性161

11.6.3 交叉抑制实验161

11.6.4 DNA测序164

11.7 表位成熟165

致谢168

参考文献168

第12章 使用展示在噬菌体上的cDNA文库进行相互作用克隆170

12.1 概述170

12.2 用于噬菌体cDNA文库展示的载体170

12.2.1 丝状噬菌体170

12.2.2 溶解性噬菌体（lytic bacteriophage）171

12.3 在基于gⅥ的展示载体中克隆cDNA文库171

12.3.1 pG6质粒简介171

12.3.2 利用PCR从预制的λGT11文库中制备cDNA插入片段172

12.3.3 连接与转化174

12.3.4 gⅥ-cDNA文库的评价及保存177

12.4 gⅥ-cDNA融合噬菌体亲和选择177

12.4.1 噬菌体文库的获取和纯化177

12.4.2 生物素化的诱饵的制备178

12.4.3 用生物素化的诱饵的淘选过程178

12.4.4 免疫亲和淘选过程179

12.5 对选择出的克隆进行分析181

12.5.1 噬菌体酶联免疫吸附反应182

12.5.2 序列分析及所筛选的cDNA的全长克隆183

12.6 应用183

致谢184

参考文献184

第13章 噬菌体抗体文库186

13.1 简介186

13.2 噬菌体抗体文库构建186

13.2.1 V区多样性的来源187

13.2.2 天然V基因的来源194

13.2.3 V基因文库的装配和克隆197

13.3 制备用于抗原上选择的噬菌体抗体205

13.4 从噬菌体文库中选择抗原特异性抗体208

13.5 识别鉴定抗原结合性抗体212

13.6 可溶性scFv片段的纯化218

13.7 问题处理218

参考文献220

第14章 噬菌体抗体的亲和力成熟222

14.1 简介222

14.2 在哪里又如何对抗体基因序列进行多样化222

14.2.1 通过位点导向突变进行CDR3多样化构建scFv文库224

14.2.2 构建用于亲和力成熟的链改组文库230

14.2.3 构建轻链改组文库235

14.3 选择和筛选亲和力更高的抗体237

14.4 筛选解离速率优化的scFv240

参考文献241

附录 普通供应商243